29 мая 2018 года в 10.00 в конференц-зале ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора состоялась научно-практическая конференция, на которой был представлен доклад на тему: «Идентификация микроорганизмов с применением газовой хроматографии – масс-спектрометрии (обзор литературы)». Автор: Захаров М.В.
Докладчик: лаборант группы геномики и протеомики Захаров М.В.
Ведущим научной конференции явился – к.м.н., с.н.с. Дуванова Ольга Владимировна
Рецензент – к.б.н., с.н.с Тынянова Виктория Ивановна.
Доклад посвящен обзору литературы по изучению метода газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией, для определения индивидуальных жирных кислот в биологических объектах. Что позволяет сократить время и стоимость исследования, благодаря отсутствию стадий повторных пересевов и тестовых биохимических ферментаций, которые особенно сложны, трудоемки и длительны.
Технология газохроматографического анализа — масс-спектрометрии заключается в определении микробных сообществ по спектру специфических компонентов их мембран и ЛПС (жирных кислот) или специфическим продуктам пиролиза и гидролиза клеточных препаратов [Хутаков Р.В., 2015]. Состав микробного сообщества может быть определен не только качественно, но и количественно [Шумилова Л.П., 2013], по тестированию различных компонентов клетки — жирные кислоты, липиды, углеводы, аминокислоты, нуклеиновых кислот и другие макромолекулы микроорганизмов [Хутаков Р.В., 2015].
Спектр жирных кислот является также фенотипической характеристикой бактериальной клетки. Вариации его состава позволяют судить о изменениях условий культивирования микроорганизма. Наиболее изучен в настоящее время регуляторный механизм адаптации бактерий к температурному режиму окружающей среды [Андрюков Б.Г., 2015].
Одним из ключевых моментов при проведении хроматографии является анализ полученных данных. При этом существуют два основных подхода. Первый подход основан на анализе времени выхода вещества и наличия нескольких значимых вторичных ионов, которые представляют собой фрагменты нелетучих соединений, несущие положительный или отрицательный заряд. Данный метод анализа является наиболее точным и дает наилучшие результаты, однако сильно зависит от используемого оборудования – одно и то же вещество будет иметь разное время выхода при использовании разных колонок. Это делает практически невозможным использования данных, полученных другими авторами, и требует создания баз данных именно на «своем» оборудовании.
Использование для идентификации только лишь ионного спектра без учета времени выхода позволяет избежать проблем, связанных с различием в оборудовании, однако дает менее точные результаты. Именно этот вариант используется при создании больших баз данных различных веществ. На данный момент в мире наибольшее распространение получили две коммерческие базы данных хроматографии-масс-спектрометрии: NIST и Wiley. Однако обе эти базы данных распространяются компаниями США, что может представлять некоторые сложности их получения ввиду санкций, вводимых против нашей страны. Помимо этого, практически все базы данных содержат масс-спектры отдельных веществ, а не целых микроорганизмов. В настоящий момент отечественные базы данных отсутствуют, что делает актуальным работы по их созданию. Особого внимания заслуживает разработка как базы масс-спектров, так и базы профилей микроорганизмов, относящиеся к особо опасной группе патогенности.
В результате, на основе высококопийного плазмидного вектора сконструирована рекомбинантная плазмида, содержащая четыре гена биосинтеза Ych (аналоги ypo1529-1532) без собственного промотора, которые экспрессируются под контролем нерегулируемого железом векторного Plac промотора. Рекомбинантная плазмида, введенная в штамм E. coli, не синтезирующий собственные сидерофоры, способствует значительной экспрессии Ych. Сравнение свойств рекомбинантного и контрольного штамма, содержащего векторную плазмиду, позволило заключить, что экспрессия Ych в клетках кишечной палочки приводит к стимуляции роста бактерий на различных средах, а также способствует защите бактерий от реактивных соединений кислорода. Анализ продукции Ych рекомбинантным штаммом выявил его перспективность для получения препарата Ych и егодальнейшей характеристики.
